RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA结合蛋白免疫沉淀）是研究体内 RNA 与蛋白结合情况的技术，主要包括RIP-qPCR和RIP-seq两种；其中RIP-qPCR用来验证与目标蛋白结合的已知RNA，RIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知RNA。
RNA免疫沉淀RIP实验原理
细胞裂解后，孵育结合了抗体的珠子，诱饵蛋白通过其抗体结合到Beads上，同时和诱饵蛋白互作的RNA，也一起沉淀到Beads上。洗涤掉未结合的RNA后，再用洗脱液将RNA-蛋白复合物从Beads洗脱下来，便得到RNA免疫沉淀产物。RIP产物既可用qPCR检测已知RNA，也可以二代测序检测未知RNA。
当没有合适的诱饵蛋白抗体时，可以通过表达融合了flag标签的诱饵蛋白，利用flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait，经裂解后与anti-Flag珠子孵育，诱饵融合蛋白与Beads结合，与诱饵融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上，再经洗涤、洗脱后做qPCR或NGS测序。
RNA免疫沉淀RIP实验流程
带标签的RNA免疫共沉淀流程图：
应用领域
RIP技术应用背景
RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类功能强大而广泛的调节因子，约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能，大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。
一方面，RBP参与RNA合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程，调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程；另一方面，RNA也会调节这些蛋白质的活性、定位或与其他蛋白质的相互作用，从而影响RBP介导的各种细胞事件。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的，干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。
目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法分为两大类：一是以感兴趣的RNA为中心，寻找与该RNA结合的蛋白质；二是以感兴趣的蛋白质为中心，寻找与该蛋白质结合的RNA。RIP（RNA免疫共沉淀）属于后者，利用特异性的抗体捕获样本中的目标蛋白，那么与目标蛋白结合的RNA也一并被捕获，之后通过qPCR或者测序技术来确定这些结合的RNA。
RNA免疫共沉淀RIP实验—客户案例
lncRNA PART1通过PLZF介导的EZH2募集导致PDGFB表观遗传沉默来抑制侵袭性胃癌
研究背景
目前的研究显示，一种长链非编码RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌症中有抑癌作用，在某些癌症中又有致癌作用。人类胃癌组织的GEO芯片数据显示，lncRNA PART1在胃癌中显著下调，TCGA数据库和GEPIA数据库信息显示低水平的lncRNA PART1更容易导致肿瘤转移和患者生存期缩短；但其临床意义和潜在机制尚未明确。
研究路线
细胞、CAM和小鼠实验均表明PART1水平与胃癌的恶性程度、转移能力呈负相关RNA-seq实验发现高表达的PART1下调了PI3K-Akt通路的一些基因，上调了肿瘤抑制基因PLZF，肿瘤组织检测和TCGA数据库资料确定了该结果RNA pulldown结合质谱鉴走技术首次发现了PART1的潜在结合蛋白——AR(已有研究表明AR可以激活前列腺瘟中的PLZF并抑制其增殖ChIP和双荧光素酶实验表明AR与PLZF启动子的2个位点结合，PLZF启动子因AR、PART1的单独作用或两者的协同作用而激活数据库调查和Co-IP结果均显示PIZF蛋白与EZH2蛋白结合ChIP-qPCR结果表明PI3K-Akt通路蛋白PDGFB的启动子与PIZF、EZH2蛋白结合、且该区域发生H3K27me3修饰功能回复实验表明， PDGFB过表达可以部分回复PART1对GC细胞生长、迁移和侵袭、等能力的抑制
研究结论
lncRNA PART1是胃癌的肿瘤抑制因子，可以作为GC转移和预后的预测因子。新发现的PART1作用机制是：PART1与AR相互作用，以雄激素非依赖性的模式激活肿瘤抑制因子PLZF，之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用，导致PI3K-Akt通路基因PDGFB的启动子发生H3K27me3修饰，从而使促癌基因PDGFB的转录活性受到抑制。
客户文献
Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2. Oncogene. 2020. (IF=9.867)
辉骏实力
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